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作者:李晨 來源:中國科學報 發布時間:2020/5/31 11:03:39
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萬能生物催化劑全長晶體結構獲破解

 

 完整酶結構      郭瑞庭供圖

電子傳遞機制      郭瑞庭供圖

5月29日,《自然—通訊》在線發表了首個細胞色素P450酶的全長精細三維結構,解答了這一數十年未解的科學難題。

湖北大學生命科學學院、省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室教授陳純琪、馬立新和郭瑞庭合作完成了這項工作。他們解析了一種P450酶CYP116B46的晶體結構,并闡明電子在分子內傳遞的方式。這對了解P450的結構及完整機理提供了重要指導,且對P450酶在醫藥和工業領域的應用具有重要價值。

萬能生物催化劑

細胞色素P450是一種酶蛋白,最早于1955年在老鼠的肝臟細胞中發現,因為其與一氧化碳結合的還原態吸收光譜波長約在450 nm而得名。

該蛋白由血紅素(heme)結構域和含有黃素單核苷酸(FMN)的還原酶結構域組成;這兩個部分通過包含鐵硫簇的鐵氧還蛋白域相連。“細胞色素P450是一個龐大的酶家族,簡稱為CYP,參與許多天然產物的合成途徑與毒物、藥物代謝反應。”論文通訊作者陳純琪告訴《中國科學報》,在植物中,P450家族參與一些特殊化合物的合成,如青蒿素和紫杉醇;在人體中,P450家族主要參與解毒過程,如化解可以導致癌癥的黃曲霉毒素等。

這是因為P450的催化多能性很高,涉及20余類反應,包括羥化反應、環氧化反應和成環反應等。其底物譜極廣,可以識別芳香族、聚酮類、萜類、肽類、糖類等類型的底物,擁有“萬能生物催化劑”之稱。

它還具有高度區域選擇性和立體選擇性,能特異性的識別結構位點和方向。此外,P450酶的底物結合區具有高度可塑性,透過酶工程改造可以改變底物譜,在重要化學品和藥物制造方面的應用深具潛力。

因此,藥物活性化與代謝主要都是由CYP這個酶家族所負責的,大約囊括了生物體中此類代謝的75%。

P450系統廣泛存在于所有生物甚至病毒中,已發現超過18000種P450系統。人體內已經發現超過57種P450系統,大部分是膜蛋白,主要分布在粒線體內膜或內質網上。不過,在大腸桿菌中未發現此類酶蛋白的蹤影。

“絕大多數P450酶需要氧化還原酶來提供電子,以活化底物結合區的血紅素,進而轉化底物。”陳純琪說,建立一個P450系統必須尋找同源或者相匹配的氧化還原酶。

在P450系統的9個家族中,只有2個家族在同一條多肽鏈上自帶氧化還原酶,被稱為自給自足的P450酶,這類酶主要來自細菌。另外一些P450系統則需要從外界獲得匹配的氧化還原酶,這種情況主要發生在動物體內。

“自給自足的P450酶在生物技術應用方面是極具吸引力的生物催化劑。因此,自給自足P450酶內部電子如何傳遞是一個非常有趣且重要的課題。”論文通訊作者郭瑞庭告訴《中國科學報》,此前,科學家已經對P450系統中的血紅素和FMN等結構域研究比較清楚,但對中間連接部分始終不了解,缺乏全長精細結構。

“在蛋白純化及培養晶體的過程中,P450酶極易從中間斷裂或降解,因而很難獲得完整的全長三維立體結構。”陳純琪說。

獲得全長P450精細三維結構

目前已知的自給自足P450酶有兩類。第一類以來源于巨大芽孢桿菌的CYP102A1為代表,由氮端的血紅素結構域和碳端的P450還原酶 (CPR)組成,電子傳遞的方向是從碳端向氮端傳遞。雖然這類P450酶的全長精細結構仍然缺失,但對于這類P450酶的電子傳遞機理也有了一些粗略的理論。

第一類自給自足P450酶結構域排列      郭瑞庭供圖

第二類是CYP116,該研究所涉及的CYP116B46就屬于這一類。這類P450由氮端的 heme結構域和碳端的鄰苯二甲酸二加氧酶還原酶類結構域(PDR)組成,PDR包含了FMN-依賴的還原酶結構域與鐵氧還蛋白結構域。

第二類自給自足P450酶結構域排列      郭瑞庭供圖

自給自足P450酶的一條多肽鏈內是如何將電子從碳端傳遞到氮端的血紅素的?由于30多年來長期缺乏全長的蛋白質結構信息,在該項研究之前尚不清楚。

英國曼徹斯特大學化學生物學教授薩賓·L·弗利奇(Sabine L. Flitsch)說:“獲得全長酶是一項了不起的成就。”許多小組,包括她自己的小組,都試圖解析這些結構,因為它們作為生物催化劑具有重大的應用潛力。

“可以說晶體制備已經超越科學,幾乎成為一門藝術。”陳純琪說,要想獲得一個完整的大蛋白晶體結構,其難度可想而知。

該研究所用的CYP116B46相對穩定,加上郭瑞庭長年從事晶體制備和結構解析工作積累的豐富經驗,他們得以利用X射線晶體學對其完整的晶體結構進行解析。

結構分析表明,在這種酶中,FMN足夠接近鐵硫簇以實現直接電子轉移;但血紅素離鐵硫簇太遠,不允許電子直接轉移,而是依靠5個“二傳手”氨基酸實現傳遞。

“我們解析了來源于CYP116B46全長的晶體結構,且建立了清晰的酶結構模型。”郭瑞庭說,這條連續性的多肽折疊成三個結構域,由兩段連接肽相連,從氮端到碳端依序為:血紅素結合域、還原酶結構域和鐵氧還蛋白結構域。

郭瑞庭介紹,結構解析后發現,CYP116B46三個結構域的排列與電子傳遞的方向竟然非常一致。血紅素結合域的底物結合區朝向外,有利于底物進入結合,這顯示結構的排列相當合理。其中,還原酶結構域和鐵氧還蛋白結構域的直線距離為7.9Å,有利于電子的直接傳遞。

“科學家普遍認為,小于8 Å的距離是電子可以直接傳遞過去的。”郭瑞庭說。

另一方面,鐵氧還蛋白結構域和血紅素的直線距離達25.3 Å,超過目前認定的有效直接電子傳遞距離。

5個“二傳手”傳遞電子

“在這兩個氧化還原中心之間,由其他輔助因子來幫助電子傳送的可能性較低。”郭瑞庭解釋說,因為結構顯示二者之間的通道狹窄,缺乏其他輔助因子結合的特征。另一方面,考慮到氨基酸也是一種電子載體,所以二者之間的氨基酸也有可能在電子傳送的過程中扮演重要角色。

“現在我們有機會設計還原酶結構域和電子轉移途徑。”陳純琪說。

為了分析這些氨基酸的側鏈基團對于CYP116B46酶活性的影響,他們將這些位點分別突變成丙氨酸,并進行產物生成量的測定來評估每個氨基酸扮演的角色。

郭瑞庭介紹,酶活測試結果顯示,R388、R718、E723、S726和E729的丙氨酸突變體活性明顯下降。將這些位點再次標定在結構上,可以看出大致的電子傳遞方向。

R378A突變體蛋白質缺乏血紅素造成的紅色,一氧化碳處理后也沒有出現吸收峰帶移的現象。加上R378的所在位置鄰近血紅素,推測R378可能與結合血紅素相關。因此,R378A的突變造成的效應更加復雜,需要進一步實驗才能判斷此一位點對于CYP116B46電子傳遞的影響。

[2Fe-2S] 與heme通道的氨基酸突變驗證         郭瑞庭供圖

“知道了氨基酸在電子傳遞過程中扮演的角色之后,我們就可以考慮尋找替換別的有效氨基酸,提高電子傳遞效率。”郭瑞庭解釋說,這就好像換上一個手更長的“二傳手”,讓電子能更快的傳遞過去。

這種設計將提高催化反應的效率。P450全長結構的解析,對于了解自給自足P450酶催化機理是一個非常重要的里程碑,對于P450酶改造與應用更具有重要的指導意義。

相關論文信息:https://doi.otg/10.1038/s41467-020-16500-5

 
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